镉胁迫下MAPKs调控下游效应蛋白初探

分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20

常娜 张蕾 黄金海 张丽琳

摘要： 镉作为非必需金属对人体健康造成很大威胁，有研究表明镉的积累会导致β淀粉样蛋白的增加[1]以及路易氏小体的形成[2]，从而引起阿尔兹海默症和帕金森症等神经退行性疾病的发生。从致病机理分析，镉通过破坏细胞内的Ca2+，NO，ROS，MAP kinase等信号通路的稳态从而导致细胞死亡[3]。目前针对MAPK的研究主要集中在MAPKs本身及其上游组分在镉胁迫下的应答方面，MAPKs的激活对下游效应蛋白的调控机制及效应蛋白种类的研究较少。 实验室前期工作发现，酵母细胞中的有丝分裂原蛋白激酶信号通路的三个核心组份（HOG1, SLT2和KSS1）基因缺失后对镉胁迫表现出了敏感性[4]，并对其中的两条途径——细胞壁完整性途径(Cell Wall Integrity, CWI)和渗透压甘油途径(High Osmolarity Glycerol, HOG)进行深入研究。本次研究以酿酒酵母野生型菌株BY4741及其背景下的HOG1和SLT2基因缺失株为研究对象，利用HiSeq2500检测50μM CdCl2胁迫下各基因表达量，选用DESeq差异表达分析软件进行样品组间的差异表达分析，并从中筛选出参与镉胁迫应答并与Hog1p和Slt2p调控相关的基因进行功能分析。随机挑选10个差异表达基因进行RT-qPCR对RNA-seq结果进行验证。 根据RNA-Seq数据，我们将差异表达基因筛选标准设定为FC>1.5，FDR<0.05，利用 GO、COG 和 KEGG 数据库对差异表达基因进行功能注释分析。结果表明，镉胁迫下hog1Δ与 BY4741相比，共有差异表达基因103个，GO注释功能主要集中在抗氧化、分子转运、新陈代谢、信号转导和应激应答等方面，与KEGG分析结果揭示出的两个主要响应途径——MAPK转导途径以及氨基酸合成代谢途径等结果相符，COG分析结果则进一步证明差异表达基因功能集中在新陈代谢及转运等过程；通过对差异表达基因的韦恩图分析得到26个受Hog1p正调控的基因，可能参与了Cd2+的运输；而TEC1、SFG1等5个基因被Hog1p负调控。镉胁迫下slt2Δ与 BY4741 菌株相比后差异表达基因有9个，三个数据库分析均证明功能集中在细胞周期调控及蛋白的合成加工方面。目前从两组缺失株调控的基因数据库中挑选出8个与离子运输、抗氧化胁迫功能相关的基因，包括NCW2、PRM5、YCT1等，分别构建了双基因缺失菌株并对其进行倍比稀释表型分析，已证明hog1yct1可以部分恢复HOG1缺失导致的镉敏感型表型，从表型结果推测YCT1位于MAPKs-Hog1p下游，相应镉原子吸收实验也证明该结论。YCT1为半胱氨酸的高亲和性转运蛋白[5]，尚无与Hog1p相关联的证据，二者互作的遗传学和理化试验的验证工作正在进行中。

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